副豬嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

雷清福¹ 譚素媚²   廖建留³  藍向波⁴

（1、廣東省佛山市南海區(qū)獅山鎮(zhèn)農村綜合辦公室，佛山528237  2、廣東四會黃崗畜牧技術服務部  3、廣東廣州市興達動物藥業(yè)有限公司，廣州511475）

 

副豬嗜血桿菌病即豬格拉譯氏病（Glasser’s disease）,又稱纖維素性漿膜炎和關節(jié)炎，其病原為副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）,是一種革蘭氏陰性短小桿菌。主要以咳嗽、呼吸困難、消瘦、關節(jié)腫脹、跛行為為主要臨床癥狀，引起豬的纖維素性漿膜炎、多發(fā)性關節(jié)炎和腦膜炎，全世界均有發(fā)生[1]。隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，規(guī)?；B(yǎng)殖和飼養(yǎng)的高度密，以及呼吸道綜合征等因素，使得該病日趨流行，同時危害也日漸嚴重。HPS血清型很多，到目前為止為止,已確定的有15個血清型，其中血清型5、4、13最為常見，占70%以上。近年來，我國由副豬嗜血桿菌引起的豬多發(fā)性漿膜炎和關節(jié)炎的報道屢見不鮮，特別是在集約化豬場中，當藍耳病，圓環(huán)病等發(fā)生后，在高密度飼養(yǎng)盒突發(fā)呼吸道疾病綜合征的情況下，該病的臨床表現和危害更為嚴重，造成更大的經濟損失。

該病主要影響哺乳仔豬及4月齡以內的保育豬和生長育肥豬，其中以5~8周齡的保育豬更為多見，發(fā)病率一般在10%—25%，嚴重時可達60%，如果處理不及時，病死率可達50%。當反復遭受各種不良應激如寒冷、轉群、換料、長途運輸等的豬群往往危害更為嚴重。有個別衛(wèi)生條件較好的豬場因不能執(zhí)行全進全出，也有類似的疾病發(fā)生，而且受影響的豬只年齡范圍也顯著增寬，發(fā)病率和死亡率也較高。副住嗜血桿菌作為共棲菌而成為繼發(fā)性病原菌，常在藍耳病病毒、圓環(huán)病毒Ⅱ型、偽狂犬病毒及豬流感病毒等感染后繼發(fā)感染,甚至與傳染性胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌等混合感染,使病情復雜化,死亡率增加。由于本菌是一種條件性致病菌，因此飼養(yǎng)管理條件的改善可降低副豬嗜血桿菌的發(fā)病率，如注意環(huán)境衛(wèi)生，處理好保溫盒通風的關系，確保飼料的質量，減少應激等[2]。

2006年9月下旬，廣東佛山某一豬場有部分約30日齡的仔豬發(fā)病，表現為精神沉郁、逐漸減食，被毛粗亂，體溫稍有升高，呼吸急促，咳喘，腹式呼吸，大部分病豬耳朵、腹部皮膚及肢體末端等發(fā)紺,指壓不褪色,拉稀，消瘦，關節(jié)腫脹，尤其是付關節(jié)和腕關節(jié)，跛行，共濟失調。據場主敘述該群發(fā)病豬只的病程已有三四天，現有2頭死亡。剖檢可見豬胸腔內、心包膜內均有多量纖維性滲出物；肺臟病變尤其明顯，除表面覆有大量纖維素性滲出物外，肺出血，肺紋理增粗；全身淋巴結腫大、暗紅色；腎、十二指腸均有出血點，四肢皮下水腫，充滿淡黃色膠凍狀液體。場主按鏈球菌病、水腫病治療無效。

據以上癥狀，懷疑為副豬嗜血桿菌病，隨采集病料進行實驗室病原分離鑒定及藥敏試驗。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病料

來自廣東佛山某養(yǎng)殖場送檢的30日齡有上述癥狀的仔豬的肺臟、肝臟、脾臟、淋巴結、鼻腔液、胸膜、心包積液、心血和關節(jié)液。

1.1.2培養(yǎng)基制作材料

營養(yǎng)肉湯粉、普通營養(yǎng)瓊脂粉、麥康凱營養(yǎng)粉等。

1.1.3主要試劑

   金黃色葡萄球菌為佛山科學技術學院預防獸醫(yī)實驗室保存；生化微量鑒定管為浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生防疫檢驗所產品；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司 ： V 因子 （NAD ， 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）購自上海伯奧生物公司 ； EX Taq DNA聚合酶（5IU/uL）、dNTPs、DNA Maker DL 2000等均由 TaKaRa公司提供，—20℃保存； 特異引物由上海博亞生物技術公司合成。

1.1.4實驗器材

核酸擴增儀、電泳儀、光學顯微鏡、凝膠成像系統等。

1.1.5 實驗動物

健康小白鼠等實驗動物由佛山黃岐實驗動物飼養(yǎng)場提供。

1.2           方法

1.2.1        培養(yǎng)基的制作

1.2.1.1普通平板的制作

營養(yǎng)瓊脂33g，溶于1000ml蒸餾水中，分裝，120℃30min高壓。取出帶溫度下降至50℃~80℃于超凈臺倒平板，凝固后包裝好放于37℃溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一夜，確認無菌后放冰箱保存，備用。

1.2.1.2血平板的制作

營養(yǎng)瓊脂33g，溶于1000ml蒸餾水中，分裝，120℃30min高壓。取出帶溫度下降至50℃左右，倒入無菌的纖綿羊或家兔血液（按5%~8%配比）混勻，于超凈臺倒平板，凝固后包裝好放于37℃溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一夜，確認無菌后放冰箱保存，備用。

1.2.1.3麥康凱平板的制作

麥康凱35g，溶于1000ml蒸餾水中，分裝，120℃30min高壓。取出帶溫度下降至50℃左右于超凈臺倒平板，凝固后包裝好放于37℃溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一夜，確認無菌后放冰箱保存，備用。

1.2.1.4巧克力平板的制作

營養(yǎng)瓊脂33g，溶于1000ml蒸餾水中，分裝，120℃30min高壓。取出帶溫度下降至75℃左右，倒入無菌的纖綿羊或家兔血液（按5%~8%配比）混勻，于超凈臺倒平板，凝固后包裝好放于37℃溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一夜，確認無菌后放冰箱保存，備用。

1.2.1.4營養(yǎng)肉湯的制作

稱取牛肉膏 5g、蛋白陳 10g、氯化鈉 5g、磷酸氫二鈉 1g、蒸餾水 1000mL，混合加熱后用0.1mol/L氫氧化鈉調至pH7.4~ pH7.6,分裝燒瓶，每瓶約5mL，121℃高壓滅菌15min~30min。取出待溫度略下降后包裝好放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中觀察一夜，確認無菌后放冰箱保存，備用。

1.2.2        細菌的分離與純化

     無菌采集鼻腔、肺臟、胸膜、心包積液、 心血和關節(jié)液等病料，分別接種于巧克力培養(yǎng)墓， 置于巧克力培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24h~48h。如果24h未見針尖或小露珠大小的菌落長出，可延長培養(yǎng)時間至48h。

     挑取可疑小菌落，進行革蘭氏染色涂片鏡檢，步驟如下[3]：

（1）      涂片：在一張載玻片上加兩滴蒸餾水后，涂布分離菌株。

（2）      固定：將制成的涂片干燥固定，固定時通過火焰5~6次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。

（3）      染色：初染，將載玻片置于玻片擱架上，加草酸銨結晶紫染色液（加量以蓋滿菌膜為度），染色1min，傾去染色液，用自來水小心地沖洗；助染，滴加碘液，染1min，同上水洗；脫色，滴加95%乙醇，脫色30s立即水洗；復染，滴加復紅，染色1min，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干后在光學顯微鏡下觀察。

     挑選疑似HPS的細小菌落進行純化培養(yǎng)，分別接種于麥康凱培養(yǎng)基、普通培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基、普通血平板各2份（各取1份置于5%~10%CO2中培養(yǎng)），37℃恒溫箱培養(yǎng)24h~48h后，觀察其在培養(yǎng)基上的生長表現、菌落特征，以及在血瓊脂平板上的溶血性等培養(yǎng)特征。

1.2.3 V因子依賴性試驗

   在無菌操作條件下，將HPS可疑純培養(yǎng)菌株分別接種于兩種營養(yǎng)肉湯中，一種是添加0.1mL V因子的營養(yǎng)肉湯，另一種是不添加V因子的營養(yǎng)肉湯，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h~48h后，對比觀察肉湯的渾濁度，進而比較細菌的生長情況，檢查其對V因子的依賴性。

1.2.4衛(wèi)星現象試驗

   在無菌操作條件下，用接種環(huán)挑取上述可疑菌的單菌落，用無菌棉簽均勻涂布于普通瓊脂平板上，再挑取金黃色葡萄球菌在上述平板中劃一組平行線，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h~48h后，觀察其是否在葡萄球菌周圍長出“衛(wèi)星現象”。

1.2.5生化鑒定

   在無菌操作條件下，在各生化鑒定管中加入2uL的1%的NAD溶液，然后取具有“衛(wèi)星現象”且不溶血的單菌落純培養(yǎng)后接種于生化微量鑒定管中，并及時用膠布封號，倒立置于一小燒杯后放入恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h，取出觀察結果，并參照常見細菌系統鑒定[4]。

1.2.6PCR鑒定

引物設計與合成參照Simone Oliveira等的報道[5],[6],[7]合成引物，引物序列為：

P1:5—TTA GCC TG CTC TTC TTA GCC—3（21 nt）

P2:5—AAG CTT GAAA ACTTAAG GGRA CTCTAA—（24 nt）

擴增片段大小為1900bp。

刮取單個待檢菌落，溶于10uL滅菌蒸餾水中個，混合均勻作為反應模板。反應體系為： 10*PCR Buffer 25uL,dNTPs(2.5mM)2uL,P1(20pmol)和P2（20pmol）各0.5uL，ExTaq（5IU/uL）0.2uL,模板1uL，滅菌雙蒸水18.3uL?；旌暇鶆蚝笾煤怂釘U增儀中執(zhí)行以下程序：94℃ 5min，94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 3min，運行30個循環(huán)；最后于72℃延伸10min。反應結束后，取5uL PCR產物中1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，凝膠成像系統中觀察結果。

 

圖1 疑似副豬嗜血桿菌顯微形態(tài)（10*100，革蘭氏染色）

 

 

1.2.7 藥敏試驗

檢測HPS菌株對16種抗生素的敏感性，將無菌棉簽抽取分離菌的肉湯培養(yǎng)物，均勻涂布于巧克力平板上，待稍干后，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼于培養(yǎng)基表面，每一平板分三個區(qū)域，貼3個藥敏紙片，37℃培養(yǎng)20~24h后，觀察并測定抑菌環(huán)直徑的大小。

1.2.8 動物致病性試驗

將10只健康小鼠隨機分為兩組，一組為對照組，另一組為實驗組(每組5只，小鼠平均重量為21g)），對照組每只小鼠腹腔注射無菌的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）液體培養(yǎng)液0.2mL，實驗組每只小鼠接種PBS稀釋的HPS菌液0.2mL，飼養(yǎng)于實驗室中，觀察并記錄其發(fā)病情況，持續(xù)多天，并對死亡小鼠取肝臟、腹腔積液等進行細菌分離鑒定。

 

2                 結果

2．1 直接涂片鏡檢

     對不同組織、部位所取的病料，經染色后均見到紅色的細小桿菌，為革蘭氏陰性桿菌。菌體形態(tài)多樣，以纖細桿狀著居多，間有長而彎曲絲狀菌體，個別呈兩極濃染的球桿狀（見圖1）。所查組織中，以心包膜和關節(jié)腔滲出物細菌最為密集。

 

 

2.2 分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性

在普通肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h~48h后，未見細菌生長。在血平板上培養(yǎng)48h，可見有針尖大小、圓形、邊緣整齊、灰白色半透明的小菌落生長，不表現溶血現象；在巧克力培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后生長良好，形成針尖大小、圓形、半透明、光滑濕潤的菌落（見圖2）；挑取菌落染色鏡檢，符合副豬嗜血桿菌的形態(tài)和染色特征。其中以5%~10%培養(yǎng)的菌落較多，涂片鏡檢，形態(tài)和染色特征與直接涂片一致。

 

(圖2 分離菌在培養(yǎng)基上的生長情況（左側圍鮮血培養(yǎng)基，右側為巧克力培養(yǎng)基）

2.3 V因子依賴性試驗結果

副豬嗜血桿菌對營養(yǎng)要求嚴格，人工培養(yǎng)時必須供給V因子才能生長。對比兩種營養(yǎng)肉湯的渾濁度發(fā)現，添加了V因子的肉湯比不添加V因子的肉湯渾濁（見圖3），說明其生長依賴V因子。

 

圖3 分離菌在營養(yǎng)肉湯上的生長情況

（1：添加了V因子的肉湯；2：不添加V因子的肉湯；3：陰性對照）

2.4衛(wèi)星現象試驗結果

金黃色葡萄球菌可產生V因子，需V因子的副豬嗜血桿菌可在其周圍呈“衛(wèi)星現象”。結果在普通瓊脂平板上金黃色葡萄球菌線兩側有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長，離金黃色葡萄球菌越近菌落越大，越遠菌落越小，遠離葡萄球菌的地方甚至不生長，呈現出明顯的“衛(wèi)星現象”（見圖4）；而在未接種金黃色葡萄球菌的普通瓊脂平板上則不生長，不見“衛(wèi)星現象”。

 

2.5 生化試驗結果

   生化試驗結果顯示：尿酶陰性，氧化酶陰性，接觸酶陽性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、木膠糖、半乳糖和麥芽糖等（見表1）。

表1 分離菌的生化實驗結果

2.6PCR鑒定結果

   經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統中觀察，發(fā)現被檢菌株都有約1900bp的特異性條帶（見圖5）。

圖5 分離菌株PCR結果電泳圖

M：Marker DL 2000;1-2:HPS 可疑純培養(yǎng)菌株；3：陰性對照

2.7藥敏試驗結果

   藥物敏感性判定標準：抑菌環(huán)直接在15mm以上為高度敏感；10~15mm為中度敏感。藥敏試驗結果表明，該菌對氯霉素、氨芐青霉素、頭孢氨芐、環(huán)丙沙星、頭孢唑林、氨芐西林、頭孢拉定高度敏感，對卡那霉素、紅霉素、諾氟沙星、桿菌肽、慶大霉素、麥迪霉素中度敏感，對四環(huán)素、鏈霉素為低毒敏感，對磺胺甲基異惡唑為耐藥（見表2）。

 注：抑菌圈直徑在15mm以上者為高敏，10-15mm為中敏，10mm以下為低敏，無菌圈者為耐藥。

2.8動物致病性試驗結果

實驗組小鼠在24h內，出現精神萎靡、食欲不振、呼吸急促、48h內全部死亡。無菌采集肺、肝等組織病料及腹腔積液接種到巧克力培養(yǎng)基和鮮血培養(yǎng)基，均長出圓形、光滑濕潤、邊緣整齊的中等大小的灰白色菌落。挑取單個小菌落涂片鏡檢發(fā)現菌株形態(tài)與上述鑒定的菌株形態(tài)極其相似。對照組小白鼠仍然很健康。

 

 

結論

從具體疑似副豬嗜血桿菌病特征臨床癥狀的病死豬身上采集的病料，同細菌分離、涂片染色鏡檢、生化鑒定、衛(wèi)星現象試驗、V因子依賴性試驗及PCR鑒定，最終確定所分離的細菌為副豬嗜血桿菌。

通過動物致病性試驗及藥敏試驗可確定分離菌HPS具有致病性，并對氨芐青霉素類、氯霉素、頭孢氨芐等藥物高度敏感，該藥敏試驗對上述豬場發(fā)生副豬嗜血桿菌病的診斷及治療可提供指導意義。

 

 

 參考文獻：

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