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     副豬嗜血桿菌病即豬格拉譯氏?。℅lasser’s disease）,又稱纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，其病原為副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）,是一種革蘭氏陰性短小桿菌。主要以咳嗽、呼吸困難、消瘦、關(guān)節(jié)腫脹、跛行為為主要臨床癥狀，引起豬的纖維素性漿膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，全世界均有發(fā)生[1]。隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，規(guī)?；B(yǎng)殖和飼養(yǎng)的高度密，以及呼吸道綜合征等因素，使得該病日趨流行，同時(shí)危害也日漸嚴(yán)重。HPS血清型很多，到目前為止為止,已確定的有15個(gè)血清型，其中血清型5、4、13最為常見，占70%以上。近年來，我國由副豬嗜血桿菌引起的豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報(bào)道屢見不鮮，特別是在集約化豬場中，當(dāng)藍(lán)耳病，圓環(huán)病等發(fā)生后，在高密度飼養(yǎng)盒突發(fā)呼吸道疾病綜合征的情況下，該病的臨床表現(xiàn)和危害更為嚴(yán)重，造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。

該病主要影響哺乳仔豬及4月齡以內(nèi)的保育豬和生長育肥豬，其中以5~8周齡的保育豬更為多見，發(fā)病率一般在10%—25%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)60%，如果處理不及時(shí)，病死率可達(dá)50%。當(dāng)反復(fù)遭受各種不良應(yīng)激如寒冷、轉(zhuǎn)群、換料、長途運(yùn)輸?shù)鹊呢i群往往危害更為嚴(yán)重。有個(gè)別衛(wèi)生條件較好的豬場因不能執(zhí)行全進(jìn)全出，也有類似的疾病發(fā)生，而且受影響的豬只年齡范圍也顯著增寬，發(fā)病率和死亡率也較高。副住嗜血桿菌作為共棲菌而成為繼發(fā)性病原菌，常在藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)病毒Ⅱ型、偽狂犬病毒及豬流感病毒等感染后繼發(fā)感染,甚至與傳染性胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌等混合感染,使病情復(fù)雜化,死亡率增加。由于本菌是一種條件性致病菌，因此飼養(yǎng)管理?xiàng)l件的改善可降低副豬嗜血桿菌的發(fā)病率，如注意環(huán)境衛(wèi)生，處理好保溫盒通風(fēng)的關(guān)系，確保飼料的質(zhì)量，減少應(yīng)激等[2]。

2006年9月下旬，廣東佛山某一豬場有部分約30日齡的仔豬發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁、逐漸減食，被毛粗亂，體溫稍有升高，呼吸急促，咳喘，腹式呼吸，大部分病豬耳朵、腹部皮膚及肢體末端等發(fā)紺,指壓不褪色,拉稀，消瘦，關(guān)節(jié)腫脹，尤其是付關(guān)節(jié)和腕關(guān)節(jié)，跛行，共濟(jì)失調(diào)。據(jù)場主敘述該群發(fā)病豬只的病程已有三四天，現(xiàn)有2頭死亡。剖檢可見豬胸腔內(nèi)、心包膜內(nèi)均有多量纖維性滲出物；肺臟病變尤其明顯，除表面覆有大量纖維素性滲出物外，肺出血，肺紋理增粗；全身淋巴結(jié)腫大、暗紅色；腎、十二指腸均有出血點(diǎn)，四肢皮下水腫，充滿淡黃色膠凍狀液體。場主按鏈球菌病、水腫病治療無效。

據(jù)以上癥狀，懷疑為副豬嗜血桿菌病，隨采集病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病料

來自廣東佛山某養(yǎng)殖場送檢的30日齡有上述癥狀的仔豬的肺臟、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、鼻腔液、胸膜、心包積液、心血和關(guān)節(jié)液。

1.1.2培養(yǎng)基制作材料

營養(yǎng)肉湯粉、普通營養(yǎng)瓊脂粉、麥康凱營養(yǎng)粉等。

1.1.3主要試劑

   金黃色葡萄球菌為佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存；生化微量鑒定管為浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生防疫檢驗(yàn)所產(chǎn)品；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司 ： V 因子 （NAD ， 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）購自上海伯奧生物公司 ； EX Taq DNA聚合酶（5IU/uL）、dNTPs、DNA Maker DL 2000等均由 TaKaRa公司提供，—20℃保存； 特異引物由上海博亞生物技術(shù)公司合成。

1.1.4實(shí)驗(yàn)器材

核酸擴(kuò)增儀、電泳儀、光學(xué)顯微鏡、凝膠成像系統(tǒng)等。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康小白鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由佛山黃岐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)場提供。

1.2           方法

1.2.1        培養(yǎng)基的制作

1.2.1.1普通平板的制作

營養(yǎng)瓊脂33g，溶于1000ml蒸餾水中，分裝，120℃30min高壓。取出帶溫度下降至50℃~80℃于超凈臺(tái)倒平板，凝固后包裝好放于37℃溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一夜，確認(rèn)無菌后放冰箱保存，備用。

1.2.1.2血平板的制作

營養(yǎng)瓊脂33g，溶于1000ml蒸餾水中，分裝，120℃30min高壓。取出帶溫度下降至50℃左右，倒入無菌的纖綿羊或家兔血液（按5%~8%配比）混勻，于超凈臺(tái)倒平板，凝固后包裝好放于37℃溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一夜，確認(rèn)無菌后放冰箱保存，備用。

1.2.1.3麥康凱平板的制作

麥康凱35g，溶于1000ml蒸餾水中，分裝，120℃30min高壓。取出帶溫度下降至50℃左右于超凈臺(tái)倒平板，凝固后包裝好放于37℃溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一夜，確認(rèn)無菌后放冰箱保存，備用。

1.2.1.4巧克力平板的制作

營養(yǎng)瓊脂33g，溶于1000ml蒸餾水中，分裝，120℃30min高壓。取出帶溫度下降至75℃左右，倒入無菌的纖綿羊或家兔血液（按5%~8%配比）混勻，于超凈臺(tái)倒平板，凝固后包裝好放于37℃溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一夜，確認(rèn)無菌后放冰箱保存，備用。

1.2.1.4營養(yǎng)肉湯的制作

稱取牛肉膏 5g、蛋白陳 10g、氯化鈉 5g、磷酸氫二鈉 1g、蒸餾水 1000mL，混合加熱后用0.1mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH7.4~ pH7.6,分裝燒瓶，每瓶約5mL，121℃高壓滅菌15min~30min。取出待溫度略下降后包裝好放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中觀察一夜，確認(rèn)無菌后放冰箱保存，備用。

1.2.2        細(xì)菌的分離與純化

     無菌采集鼻腔、肺臟、胸膜、心包積液、 心血和關(guān)節(jié)液等病料，分別接種于巧克力培養(yǎng)墓， 置于巧克力培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24h~48h。如果24h未見針尖或小露珠大小的菌落長出，可延長培養(yǎng)時(shí)間至48h。

     挑取可疑小菌落，進(jìn)行革蘭氏染色涂片鏡檢，步驟如下[3]：

（1）      涂片：在一張載玻片上加兩滴蒸餾水后，涂布分離菌株。

（2）      固定：將制成的涂片干燥固定，固定時(shí)通過火焰5~6次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。

（3）      染色：初染，將載玻片置于玻片擱架上，加草酸銨結(jié)晶紫染色液（加量以蓋滿菌膜為度），染色1min，傾去染色液，用自來水小心地沖洗；助染，滴加碘液，染1min，同上水洗；脫色，滴加95%乙醇，脫色30s立即水洗；復(fù)染，滴加復(fù)紅，染色1min，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

     挑選疑似HPS的細(xì)小菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，分別接種于麥康凱培養(yǎng)基、普通培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基、普通血平板各2份（各取1份置于5%~10%CO2中培養(yǎng)），37℃恒溫箱培養(yǎng)24h~48h后，觀察其在培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)、菌落特征，以及在血瓊脂平板上的溶血性等培養(yǎng)特征。

1.2.3 V因子依賴性試驗(yàn)

   在無菌操作條件下，將HPS可疑純培養(yǎng)菌株分別接種于兩種營養(yǎng)肉湯中，一種是添加0.1mL V因子的營養(yǎng)肉湯，另一種是不添加V因子的營養(yǎng)肉湯，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h~48h后，對(duì)比觀察肉湯的渾濁度，進(jìn)而比較細(xì)菌的生長情況，檢查其對(duì)V因子的依賴性。

1.2.4衛(wèi)星現(xiàn)象試驗(yàn)

   在無菌操作條件下，用接種環(huán)挑取上述可疑菌的單菌落，用無菌棉簽均勻涂布于普通瓊脂平板上，再挑取金黃色葡萄球菌在上述平板中劃一組平行線，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h~48h后，觀察其是否在葡萄球菌周圍長出“衛(wèi)星現(xiàn)象”。

1.2.5生化鑒定

   在無菌操作條件下，在各生化鑒定管中加入2uL的1%的NAD溶液，然后取具有“衛(wèi)星現(xiàn)象”且不溶血的單菌落純培養(yǎng)后接種于生化微量鑒定管中，并及時(shí)用膠布封號(hào)，倒立置于一小燒杯后放入恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h，取出觀察結(jié)果，并參照常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定[4]。

1.2.6PCR鑒定

引物設(shè)計(jì)與合成參照Simone Oliveira等的報(bào)道[5],[6],[7]合成引物，引物序列為：

P1:5—TTA GCC TG CTC TTC TTA GCC—3（21 nt）

P2:5—AAG CTT GAAA ACTTAAG GGRA CTCTAA—（24 nt）

擴(kuò)增片段大小為1900bp。

刮取單個(gè)待檢菌落，溶于10uL滅菌蒸餾水中個(gè)，混合均勻作為反應(yīng)模板。反應(yīng)體系為： 10*PCR Buffer 25uL,dNTPs(2.5mM)2uL,P1(20pmol)和P2（20pmol）各0.5uL，ExTaq（5IU/uL）0.2uL,模板1uL，滅菌雙蒸水18.3uL。混合均勻后置核酸擴(kuò)增儀中執(zhí)行以下程序：94℃ 5min，94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 3min，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)；最后于72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5uL PCR產(chǎn)物中1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

 

圖1 疑似副豬嗜血桿菌顯微形態(tài)（10*100，革蘭氏染色）

 

 

1.2.7 藥敏試驗(yàn)

檢測(cè)HPS菌株對(duì)16種抗生素的敏感性，將無菌棉簽抽取分離菌的肉湯培養(yǎng)物，均勻涂布于巧克力平板上，待稍干后，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼于培養(yǎng)基表面，每一平板分三個(gè)區(qū)域，貼3個(gè)藥敏紙片，37℃培養(yǎng)20~24h后，觀察并測(cè)定抑菌環(huán)直徑的大小。

1.2.8 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

將10只健康小鼠隨機(jī)分為兩組，一組為對(duì)照組，另一組為實(shí)驗(yàn)組(每組5只，小鼠平均重量為21g)），對(duì)照組每只小鼠腹腔注射無菌的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）液體培養(yǎng)液0.2mL，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠接種PBS稀釋的HPS菌液0.2mL，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室中，觀察并記錄其發(fā)病情況，持續(xù)多天，并對(duì)死亡小鼠取肝臟、腹腔積液等進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

 

2                 結(jié)果

2．1 直接涂片鏡檢

     對(duì)不同組織、部位所取的病料，經(jīng)染色后均見到紅色的細(xì)小桿菌，為革蘭氏陰性桿菌。菌體形態(tài)多樣，以纖細(xì)桿狀著居多，間有長而彎曲絲狀菌體，個(gè)別呈兩極濃染的球桿狀（見圖1）。所查組織中，以心包膜和關(guān)節(jié)腔滲出物細(xì)菌最為密集。

 

 

2.2 分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性

在普通肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h~48h后，未見細(xì)菌生長。在血平板上培養(yǎng)48h，可見有針尖大小、圓形、邊緣整齊、灰白色半透明的小菌落生長，不表現(xiàn)溶血現(xiàn)象；在巧克力培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后生長良好，形成針尖大小、圓形、半透明、光滑濕潤的菌落（見圖2）；挑取菌落染色鏡檢，符合副豬嗜血桿菌的形態(tài)和染色特征。其中以5%~10%培養(yǎng)的菌落較多，涂片鏡檢，形態(tài)和染色特征與直接涂片一致。

 

(圖2 分離菌在培養(yǎng)基上的生長情況（左側(cè)圍鮮血培養(yǎng)基，右側(cè)為巧克力培養(yǎng)基）

2.3 V因子依賴性試驗(yàn)結(jié)果

副豬嗜血桿菌對(duì)營養(yǎng)要求嚴(yán)格，人工培養(yǎng)時(shí)必須供給V因子才能生長。對(duì)比兩種營養(yǎng)肉湯的渾濁度發(fā)現(xiàn)，添加了V因子的肉湯比不添加V因子的肉湯渾濁（見圖3），說明其生長依賴V因子。

 

 

圖3 分離菌在營養(yǎng)肉湯上的生長情況

 

（1：添加了V因子的肉湯；2：不添加V因子的肉湯；3：陰性對(duì)照）

2.4衛(wèi)星現(xiàn)象試驗(yàn)結(jié)果

金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生V因子，需V因子的副豬嗜血桿菌可在其周圍呈“衛(wèi)星現(xiàn)象”。結(jié)果在普通瓊脂平板上金黃色葡萄球菌線兩側(cè)有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長，離金黃色葡萄球菌越近菌落越大，越遠(yuǎn)菌落越小，遠(yuǎn)離葡萄球菌的地方甚至不生長，呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”（見圖4）；而在未接種金黃色葡萄球菌的普通瓊脂平板上則不生長，不見“衛(wèi)星現(xiàn)象”。

 

2.5 生化試驗(yàn)結(jié)果

   生化試驗(yàn)結(jié)果顯示：尿酶陰性，氧化酶陰性，接觸酶陽性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、木膠糖、半乳糖和麥芽糖等（見表1）。

表1 分離菌的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

 

2.6PCR鑒定結(jié)果

   經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，發(fā)現(xiàn)被檢菌株都有約1900bp的特異性條帶（見圖5）。

 

圖5 分離菌株P(guān)CR結(jié)果電泳圖

M：Marker DL 2000;1-2:HPS 可疑純培養(yǎng)菌株；3：陰性對(duì)照

2.7藥敏試驗(yàn)結(jié)果

   藥物敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌環(huán)直接在15mm以上為高度敏感；10~15mm為中度敏感。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌對(duì)氯霉素、氨芐青霉素、頭孢氨芐、環(huán)丙沙星、頭孢唑林、氨芐西林、頭孢拉定高度敏感，對(duì)卡那霉素、紅霉素、諾氟沙星、桿菌肽、慶大霉素、麥迪霉素中度敏感，對(duì)四環(huán)素、鏈霉素為低毒敏感，對(duì)磺胺甲基異惡唑?yàn)槟退帲ㄒ姳?）。

 

 注：抑菌圈直徑在15mm以上者為高敏，10-15mm為中敏，10mm以下為低敏，無菌圈者為耐藥。

2.8動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組小鼠在24h內(nèi)，出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、呼吸急促、48h內(nèi)全部死亡。無菌采集肺、肝等組織病料及腹腔積液接種到巧克力培養(yǎng)基和鮮血培養(yǎng)基，均長出圓形、光滑濕潤、邊緣整齊的中等大小的灰白色菌落。挑取單個(gè)小菌落涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)菌株形態(tài)與上述鑒定的菌株形態(tài)極其相似。對(duì)照組小白鼠仍然很健康。

 

 

結(jié)論

從具體疑似副豬嗜血桿菌病特征臨床癥狀的病死豬身上采集的病料，同細(xì)菌分離、涂片染色鏡檢、生化鑒定、衛(wèi)星現(xiàn)象試驗(yàn)、V因子依賴性試驗(yàn)及PCR鑒定，最終確定所分離的細(xì)菌為副豬嗜血桿菌。

通過動(dòng)物致病性試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)可確定分離菌HPS具有致病性，并對(duì)氨芐青霉素類、氯霉素、頭孢氨芐等藥物高度敏感，該藥敏試驗(yàn)對(duì)上述豬場發(fā)生副豬嗜血桿菌病的診斷及治療可提供指導(dǎo)意義。

 

 

 

 

 

 

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